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Plasmid의 특징 및 분리
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1. Plasmid의 특징
Plasmid는 박테리아 세포 내에 독립적으로 존재하는 환형의 DNA 분자이다. 이들은 대부분 하나 이상의 유전자를 가지고 있으며, 이들 유전자는 종종 숙주세균에 의해 보여지는 유용한 특징을 담당하고 있다. 예를 들어 항생제의 정상적인 독성농도에서 생존하는 능력은 항생제 저항성 유전자를 가진 plasmid가 세균 내에 존재하기 때문이다. 실험실에서 이러한 항생제 저항성은 종종 선별표지(Selection marker)로 이용된다. 모든 plasmid는 복제 개시점(origin of replication)이 될 수 있는 최소한 한 개의 DNA 염기서열을 갖고 있어서 세포 내에서 세균의 염색체와는 독립적으로 복제할 수 있다. 어떤 plasmid는 세균의 염색체 속으로 자신을 삽입시켜 복제한다. 이러한 plasmid (episome)들은 수많은 세포분열 동안 그 염색체 속에서 그 형태기 안정적으로 다음 세대로 유전된다. Plasmid의 크기는 1kb～250kb 이상까지 다양하다.
복제개수(copy number)란 하나의 세균세포 내에 존재하는 각각의 plasmid의 갯수이다(1개～500개 이상). 좋은 클로닝 운반체가 될려면 복제개수가 많은 것이 좋다.
2. 대장균으로부터 Plasmid의 분리
Plasmid DNA를 분리하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 여기서는 가장 보편적으로 사용되는 방법인 Alkali lysis 방법을 소개한다. 기본적인 원리는 세균의 세포벽과 세포막을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다. 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 염색체 DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 그러나 염색체 DNA는 상대적으로 플라스미드에 비해 매우 크기 때문에 이런 성질을 이용하면 분리할 수 있다.
Alkali lysis 방법은 다음과 같다.
1) 배양접시에서 자란 세포를 액체 배지에 대량 배양한다.
2) 자란 세포들을 원심분리하여 배지를 따라버리고 가라앉은 세포들에 solutionⅠ을 처리하여 세포들을 강하게 풀어준다.
→ solutionⅠ은 세포벽을 파괴하고, 삼투압을 유지시켜 세포의 외형은 유지해준다. 그리고 염색체 DNA는 파괴되지 않도록 세포를 유지시킨다.
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