자연과학 다운로드 생화학 실험 - Western Blot 실험 결과 레폿 YG

자연과학 다운로드 생화학 실험 - Western Blot 실험 결과 레폿
 

Western Blot 실험 결과
-실험 제목 : Western blot
-실험날짜 :

-실험 목적
: 단백질을 크기별로 분리하는 기술로 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질만을 Detection 할 수 있다.
이번 Western Blotting은 뉴런으로 분화하기 전인 Neuroblastoma(Ne,신경모세포)를 사용해 신경모세포가 암이 되게 유발하는 단백질을 찾을 수 있다.
-실험 방법
1) Sampling (Protein Extraction)
추출해 낼 세포에 Lysis buffer를 넣고 4도씨에서 원심 분리를 한다.
(Lysis buffer는 세포막을 파괴하는 역할을 한다.)
inner membrane과 outer membrane을 준비해 캐스터에 끼운 후 membrane 사이에 증류수를 넣어 물질이 새는지 시간을 두고 관찰한 뒤 새지 않으면 증류수는 버린다.
50ml 튜브에 폴리아크릴아마이드 3.4ml, TDS와 SDS를 합하여 2.5ml, D.W 4.1ml를 넣고 혼합한 뒤 membrane 사이에 넣어준다.
Lane을 표시할 comb를 넣는다.
Gel을 굳힐 때는 10% AP(Ammonium Persulfate와 TEMED를 사용한다.

2) SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - poly acrylamid gel elextrophoresis)
E-tube에 각각의 Sample 32㎕, 프루프 버퍼 8㎕ (SDS, Tris)를 넣는다.
-`Sample①Ne ②Ne+RA(Retinoic Acid, 분화제) ③NE+Benzo[α]Pypene 0.1ml ④NE+Benzo[α]Pypene 0.3ml ⑤NE+Benzo[α]Pypene 1ml ⑥NE+Benzo[α]Pypene 3ml
(SDS와 Tris가 단백질의 이황화 구조를 끊거나 3차 구조를 풀어 실처럼 만들고 모든 아미노산의 전하를 (-)로 바꿔 동일하게 만든다.)
E-tube에 캡을 씌운 후 동동이에 띄워서 100도씨에서 5분간 끓인다.
(끓인 후 Sample들은 얼음에 차갑게 보관한다.)
Gel이 굳었는지 확인한 후 comb를 조심스럽게 빼낸다.
membrane(inner membrane을 안쪽에 위치하도록 준비)과 running buffer(Tris+glycine+ 10% SDS)를 전기 영동기에 넣고 준비한다.
lane 2부터 전기영동 기준이 되는 marker를 넣고, lane 3부터 lane 8까지 Sample을 8ul씩 채워넣는다.
(이때 pipette tip은 끝이 얇은 로딩 팁을 쓰고 시료를 넣을 때 Gel이 상하지 않도록 주의한다.)
120V에서 1시간 20분 동안 전기영동을 진행한다.

3) Transfer
전기영동이 끝나면 membrane을 꺼내 Gel을 membrane으로부터 분리해낸 다음 Gel의 필요 없는 부분은 자르고 Washing한다.
PVDF Transfer paper를 Gel 크기보다 조금 넉넉하게…(생략)
 

  
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